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          脊髓損傷(SCI)會(huì)產(chǎn)生以損傷相關(guān)分子模式(DAMP)和免疫細(xì)胞激活為特征的炎癥微環(huán)境，這會(huì)加劇繼發(fā)性損傷并損害神經(jīng)功能恢復(fù)。此外，受損脊髓中巨噬細(xì)胞的發(fā)生不平衡極化。促炎性M1表型巨噬細(xì)胞的激活水平持續(xù)升高，而潛在的修復(fù)性M2表型巨噬細(xì)胞的激活水平降低，導(dǎo)致炎癥持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)和組織重塑失敗。另一方面，SCI炎癥微環(huán)境不利于神經(jīng)干細(xì)胞的存活、遷移和分化，嚴(yán)重阻礙了內(nèi)源神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞在損傷后的軸突生長(zhǎng)及神經(jīng)分化再生作用，影響損傷區(qū)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重建以及功能的恢復(fù)。因此，重建SCI免疫炎癥微環(huán)境對(duì)提升脊髓再生修復(fù)的效果十分關(guān)鍵。

圖1：一種免疫調(diào)節(jié)性水凝膠支架促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)再生的示意圖

   左：用陽離子聚合物聚(酰胺胺)和抗炎細(xì)胞因子IL-10修飾的光交聯(lián)明膠水凝膠。該支架在體外促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化和神經(jīng)元分化。右：移植雙功能免疫調(diào)節(jié)支架到到小鼠脊髓損傷部位，在此清除DAMPs，減少炎癥，并增強(qiáng)組織重塑和神經(jīng)再生。

圖2：水凝膠支架的表征

   (A)為GL(明膠)、Scav-GL(明膠+PAAM-G3)、Delv-GL(明膠+IL-10) 和 Scav/Delv-GL(明膠+ PAAM-G3+ IL-10) 支架的掃描電鏡圖像，圖像表明所有支架的孔徑相似，孔徑為60-180μm。(B)支架的壓縮模量。(C)水凝膠支架7、14、21和28天的體外降解率。(D)DAMP溶液中總蛋白質(zhì)的清除百分率。(E)HMGB1和(F)細(xì)胞外DNA的水平在SCAV-GL支架孵育后的水平。(D-F)表明用含有PAAM-G3的支架處理后，無細(xì)胞DNA(cfDNA)和HMGB1蛋白(陰離子DAMP)的量以及溶液中總蛋白的量減少。(G)一天后，Delv-GL和Scav/Delv-GL水凝膠分別釋放了大約24.4%和23.7%負(fù)載的IL-10，隨后IL-10逐漸釋放，IL-10在SCAV/Delv-GL支架中釋放21d的比例約為52.4%。在水凝膠中加入PAMAM-G3對(duì)IL-10的緩釋行為無明顯影響。

圖3：Scav/Delv-GL支架對(duì)巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞促炎活性的調(diào)節(jié)

   (A)白介素(IL-1β)， (B) TNF-α和(C) iNOS在經(jīng)DAMPs刺激和PBS, GL, Scav-GL, Delv-GL或Scav/Delv-GL支架處理后M1極化RAW264.7細(xì)胞中的定量表達(dá)。(D)iNOS的免疫熒光染色，Scav /Delv-GL組中iNOS陽性染色的細(xì)胞數(shù)量減少。(E)IL-1β、(F)TNF-α 和(G)iNOS的基因表達(dá)水平。(H)在 DAMPs 刺激后用 PBS、GL、Scav-GL、Delv-GL 或 Scav/Delv-GL 支架處理M1極化BV2細(xì)胞的iNOS的免疫熒光圖像。表明Scav/Delv-GL治療組的iNOS表達(dá)顯著低于所有其他組。這些結(jié)果表明，免疫調(diào)節(jié)支架(Scav-GL，Delv-GL和Scav / Delv-GL)顯著抑制DAMP誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中的促炎反應(yīng)。

圖4：Scav/Delv-GL支架在神經(jīng)元分化中的作用

   對(duì)神經(jīng)特異性分化標(biāo)志物微管蛋白(Tuj-1)進(jìn)行免疫染色的圖像(神經(jīng)元：Tuj-1，綠色;細(xì)胞核：DAPI，藍(lán)色。)。在將DAMPs添加到神經(jīng)源性分化培養(yǎng)基后，觀察到的Tuj-1陽性細(xì)胞很少，這表明DAMPs對(duì)神經(jīng)發(fā)生的抑制作用?？瞻姿z(GL)并沒有減輕 DAMPs 對(duì)NSCs的影響。Scav / Delv-GL和Scav-GL組中Tuj-1陽性神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量顯著升高，表明神經(jīng)源性分化更大。Delv-GL組中暴露于DAMPs的Tuj-1陽性細(xì)胞數(shù)量也有所增加，但分化程度低于Scav / Delv-GL和Scav-GL治療組。

圖5：在急性期，Scav / Delv-GL支架的植入減少了促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，并減少了病變部位的巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量

   (A)為SCI后第7天對(duì)照組，GL組，Scav-GL組，Delv-GL組和Scav / Delv-GL組脊髓組織中炎癥細(xì)胞因子水平變化的熱圖分析， Scav / Delv-GL組中促炎細(xì)胞因子的濃度顯著降低。(B)各組SCI小鼠脊髓組織中IL-1β和TNF-α表達(dá)的圖像，(C-D)為(B)中各組的定量分析。(E-J)通過免疫染色觀察SCI急性期病變區(qū)巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的分布和免疫表型，檢測(cè)ED1(反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬菌體標(biāo)志物)，F(xiàn)4/80(巨噬細(xì)胞標(biāo)志物)和Iba-1(小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物)的表達(dá)。圖像顯示Scav/ Delv-GL組的陽性染色巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量顯著低于其他四組。結(jié)果表明在脊髓損傷部位植入Scav/Delv-GL和Scav-GL支架可減少急性期促炎細(xì)胞因子的分泌。

圖6：Scav/Delv-GL支架植入調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞亞型

   (A-D)損傷后7天對(duì)照組、GL、Scav-GL、Delv-GL和Scav/Delv-GL組中iNOS 和ARG-1的免疫熒光染色圖像與定量分析。iNOS(M1型)和ARG-1(M2型)。圖像表明，損傷后第7天，Scav/Delv-GL組和Scav-GL組損傷部位和周圍組織區(qū)域iNOS陽性細(xì)胞數(shù)量明顯低于對(duì)照組和GL組。在損傷區(qū)域植入水凝膠支架，特別是Delv-GL支架增加了ARG-1陽性細(xì)胞的數(shù)量，這表明Scav / Delv-GL支架調(diào)節(jié)了SCI急性期受損脊髓中巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的M1 / M2極化。

圖7：病變部位的長(zhǎng)期炎癥反應(yīng)

   (A-C)手術(shù)后 8 周，對(duì)照組、GL、Scav-GL、Delv-GL 和 Scav/Delv-GL組中的IL-1β和TNF-α表達(dá)水平和ED1、F4/80和Iba-1免疫熒光染色。結(jié)果表明Scav-GL組、Delv-GL組和Scav/Delv-GL組IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平低于未處理的對(duì)照組和GL組。此外，在植入Scav / Delv-GL支架的小鼠受損組織的中心區(qū)域發(fā)現(xiàn)的ED1，F(xiàn)4 / 80和Iba-1陽性細(xì)胞明顯少于其他四組。結(jié)果表明，免疫調(diào)節(jié)功能支架，特別是 Scav/Delv-GL支架，減弱了長(zhǎng)期的促炎反應(yīng)，因此有助于減少 SCI 后慢性期的炎癥微環(huán)境。這些結(jié)果表明，免疫調(diào)節(jié)功能支架，特別是 Scav/Delv-GL支架，減弱了長(zhǎng)期的促炎反應(yīng)，因此有助于改善SCI后慢性期的炎癥微環(huán)境。

圖8：神經(jīng)再生和功能恢復(fù)

   (A)SCI第7天各組小鼠病變部位的Tuj-1陽性軸突熒光染色。圖像表明，在手術(shù)后七天，Scav / Delv-GL和Delv-GL組中Tuj-1陽性新生成的神經(jīng)元數(shù)量高于Scav-GL，GL和未治療的對(duì)照組。(B-C)：病變中心的Tuj-1陽性細(xì)胞和術(shù)后8周對(duì)照各組中脊髓組織樣本的MAP2表達(dá)水平。(D-F)術(shù)后8周各組后肢的運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(MEPs)響應(yīng)于大腦的電刺激。觀察到用Scav / Delv-GL支架治療的小鼠(平均潛伏期3.39 ± 0.06毫秒；平均MEP振幅0.14 ± 0.02 mV)治療的小鼠的運(yùn)動(dòng)誘發(fā)反應(yīng)比用Scav-GL處理的小鼠(平均潛伏期4.28±0.84毫秒；平均幅度0.12 ± 0.05 mV)或Delv-GL(平均潛伏期4.17 ± 0.79毫秒；平均幅度：0.11 ± 0.04 mV)更大。(G)為不同組小鼠后肢野外行走得分(BMS)評(píng)分。這些結(jié)果表明，DAMP 清除和 IL-10 緩釋對(duì)于 SCI 模型中的長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)都很重要。

【總結(jié)】

   在脊髓損傷中，病變部位及其周圍的免疫微環(huán)境在神經(jīng)再生和功能恢復(fù)中起著重要作用。這篇文章開發(fā)了一種清除DAMP并緩慢釋放 IL-10的雙功能免疫調(diào)節(jié)支架，該支架可減少促炎細(xì)胞，同時(shí)增強(qiáng)抗炎細(xì)胞反應(yīng)，加速神經(jīng)再生，并改善運(yùn)動(dòng)的長(zhǎng)期恢復(fù)體內(nèi)功能。